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利用SC-ICP-MS 法测定单个细菌细胞中的铁含量
点击次数:368 发布日期:2019-1-25  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
 
优势
ICP-MS 法可以分析成批培养的细菌细胞中的总金属含量,然后根据测得的细胞总数平均算出单个细菌细胞的铁含量。由于平板计数法无法计算死亡细胞或未被培养的完整细胞,导致计数出现误差。然而,由于仪器的限制,目前还未见有方法可直接分析单个细菌细胞中的铁含量。基于单细胞ICP-MS (SC-ICP-MS) 分析技术取得的重大进展,使得直接测定单个细胞内金属含量成为现实。PerkinElmer 公司专利的Asperon™单细胞雾室将单个完整细胞引入ICP-MS的等离子体中,结合NexION® 系列ICP-MS 质谱仪瞬时采集速度快的优势,可确定单个细菌细胞内的铁含量。在本次实验中,我们利用SC-ICP-MS 法分别测定了三种菌株的单个细胞的铁含量。这三个菌株分别是大肠杆菌B (Eco)、枯草芽孢杆菌168 (BAC) 和红球菌RHA1 (RHA)SC-ICP-MS 技术可直接测定单个细胞的铁含量,并确定每种菌株的铁含量分布情况。铁含量与细菌的细胞大小相关,即最大菌株(RHA)单个细胞的平均铁含量最高,而最小菌株(Eco) 单个细胞的平均铁含量最低。
 
内容简介
对于SC-ICP-MS 分析,大肠杆菌B 株、枯草芽孢杆菌168 株和红球菌RHA1 株均生长至具有相同的光密度,并离心至一个细菌细胞聚合体上。然后,立即将样品冷冻、冷冻干燥并混匀。称取制备好的样品(10 - 30 mg) 放入Savillex® PFA 中。加入Optima® 级浓硝酸在电热板上进行密闭消解。消解后将样品加热至近干,复溶于5 mL 0.05 M HNO3 中。加拿大国家研究院的NRCC 龙虾肝胰脏(TORT-1) 作为标准参考物质。使用纯氨气的反应模式分析56Fe
 
仅用于研究。不可用于诊断。
 
引言
 
铁是细菌细胞内部进行各种生物过程所必须的金属辅助因子。通常,铁作为一种可抑制细菌生长的营养元素,细胞中的总铁含量限额取决于细胞的生长状态和代谢需要。细菌已进化出复杂的系统来调节细胞中铁含量。 1 细胞内多余的可溶性铁是有毒的,这是由于过量的可溶性铁产生会损伤细胞组分的活性氧,这意味着必须严格控制细胞中的铁含量。然而,目前我们尚无法确定单个细胞内及整个细胞群内铁含量的调节情况。在确定细胞生长条件和应激反应的影响时,包括因使用抗生素产生的应激反应,在近乎实时地测定细菌细胞中的铁含量可提供关于细菌中铁耐受限值的信息。有趣的是,某些具有杀菌作用的粘土矿物和粘土提取物中的可溶性铁含量很高,这可能会破坏细菌细胞内的铁平衡,导致细菌死亡。 2 此外,监测单个细胞内的铁含量还可了解细胞中铁的分布情况,从而确定细胞群的同质性。

ICP-MS 法可以分析成批培养的细菌细胞中的总金属含量,然后根据测得的细胞总数平均算出单个细菌细胞的铁含量。 3 由于平板计数法无法计算死亡细胞或未被培养的完整细胞,导致计数出现误差。然而,由于仪器的限制,目前还未见有方法可直接分析单个细菌细胞中的铁含量。

基于单细胞 ICP-MS (SC-ICP-MS) 分析技术取得的重大进展,使得直接测定单个细胞内金属含量成为现实。 PerkinElmer 公司专利的 Asperon™单细胞雾室将单个完整细胞引入 ICP-MS的等离子体中,结合 NexION® 系列 ICP-MS 质谱仪瞬时采集速度快的优势,可确定单个细菌细胞内的铁含量。在本次实验中,我们利用 SC-ICP-MS 法分别测定了三种菌株的单个细胞的铁含量。这三个菌株分别是大肠杆菌 B (Eco)枯草芽孢杆菌 168 (BAC) 红球菌 RHA1 (RHA)SC-ICP-MS 技术可直接测定单个细胞的铁含量,并确定每种菌株的铁含量分布情况。铁含量与细菌的细胞大小相关,即最大菌株 (RHA)单个细胞的平均铁含量最高,而最小菌株 (Eco) 单个细胞的平均铁含量最低。

实验

细菌培养物

本次实验分析了三种非致病性菌株,即大肠杆菌 B (Eco)
枯草芽孢杆菌 168 (BAC) 红球菌 RHA1 (RHA)。根据以前的文献报道,上述菌株的细胞尺寸分别约为 2 µm4 µm10 µm ± 24-6 在本次实验中,平板分离的单克隆菌落分别接种于 3 5mL LB 培养基试管中培养,然后在振荡培养箱中以 200 rpm 速度, 37过夜培养大肠杆菌 B 株和枯草芽孢杆菌 168 株;在振荡培养箱中以 200 rpm 速度,于 30过夜培养红球菌 RHA1 株。

从每种过夜培养物中取一份等分样本
(1 mL)
,接入到已经预热的含有 250 mL LB 培养基的烧瓶中,并将烧瓶放回振荡培养箱中,使得菌落在上述条件下继续生长。定期从每个烧瓶中取等分样本 (1 mL),使用 Cary 50 Bio 紫外可见分光光度计(Varian) 监测光密度 (OD600)。大肠杆菌 B 株和枯草芽孢杆菌168 株持续生长,直至进入后期对数生长期,最终 OD600 分别为 1.7 1.4。红球菌 RHA1 株持续生长,直至进入后期稳定期,最终 OD600 2.3

培养物被等分成
1 mL 样本,并储存在 50% 的甘油中于 -20
保存,然后进行 SC-ICP-MS
分析。菌落密度使用平板计数法进行单位体积菌落数统计。

SC-ICP-MS 分析

将细菌细胞样品(表 1)放入 35水浴中解冻 1min
,然后将样品置于冰袋,使用 1% 磷酸盐缓冲液 (PBS) 将样品稀释至含有 100,000 个细胞 /mL-1 的样品稀释液后立即上机 SC-ICP-MS分析。样品在使用前应单独解冻,以防止细菌随着时间推移而降解。 SC-ICP-MS dwell time50 µs(停留时间),每个样品分析时间 1min,重复测定三次。测试将消耗 100 µL 样品。通过采用 ICPMS 的纯氨气通入反应池的模式(反应模式),消除ArO+ 56Fe+ 的干扰。 SC-ICP-MS 工作条件见表 2

本次实验利用浓度为 50,000 part/mL NIST 60 nm (8013) 金纳米颗粒标准物质,和浓度为 33,000 part/mL 的含有镧系金属(CeEuHo Lu)的 Fluidgim 2.5 µm 聚苯乙烯微球来测试方法传输(TE)。使用浓度分别为 12 3 ppb Fe 离子标准液进行溶解离子校准。所有校准标准液的基质均与样品基质匹配,均使用 1% PBS 制备。



ICP-MS
分析

对于 SC-ICP-MS 分析,大肠杆菌 B 株、枯草芽孢杆菌 168
株和红球菌 RHA1 株均生长至具有相同的光密度,并离心至一个细菌细胞聚合体上。然后,立即将样品冷冻、冷冻干燥并混匀。称取制备好的样品 (10 - 30 mg) 放入 Savillex® PFA 中。加入Optima® 级浓硝酸在电热板上进行密闭消解。消解后将样品加热至近干,复溶于 5 mL 0.05 M HNO3 中。加拿大国家研究院的 NRCC 龙虾肝胰脏 (TORT-1) 作为标准参考物质。使用纯氨气的反应模式分析 56FeICP-MS 质谱仪的工作条件见表 2)。

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