English | 中文版 | 优发官网游戏下载安装版 企业登录 | 个人登录 | 邮件订阅
厂商 仪器 试剂 服务 新闻 文章 视频 高级搜索
当前身分 > mg娱乐场 > 技术文章 > 核酸分子杂交法
核酸分子杂交法
点击次数:5395 公布日期:2008-12-14  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。基本原理是具有肯定同源性的两条核酸单链在肯定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则形成双链,此杂交进程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。探针以放射核素或非放射性核素标志,以利于杂交信号的检测。  

所谓杂交(hydridization)指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体(hybrid),杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。使用两条差别来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术,它是指使用标志分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术,我们把标志的分子叫探针(Probe)。将探针技术与分子杂交技术相结合,从而使分子杂交技术得以普遍推广应用。当前所用的核酸杂交技术均应用了标志技术。  

(一)DNA的变性  DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无法则线团,称为DNA变性。加热、改变DNA溶液中的pH,或有机溶剂等理化因素的影响,均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外汲取增加。  
(二)DNA复性  变性DNA只要消除变性条件,二条互补链还能够重新结合,回复原来的双螺旋结构,这一进程称为复性。复性后的DNA,理化性质都能得到回复。  核酸分子单链之间有互补的碱基顺次,通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区,这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺次完全互补,所以差别来源的核酸单链只要彼此之间有肯定程度的互补顺次就能够形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间,由于DNA一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成为单链,这一进程称为变性,一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合成双链进程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素标志成为探针,再与另一种核酸单链进行分子杂交。  
(三)探针——靶分子反应  从化学和生物学意义上了解,探针是一种分子,它带有供反应后检测的适合标志物,并与特异靶分子反应。抗体——抗体、外源凝集素——碳水化合物、亲合素——生物素、受体——配基(Ligand)以及互补核酸间的杂交均属于探针——靶分子反应,蛋白质探针(如抗体)与特异靶分子是通过混合力(疏水离子和氢键)的作用在少数特异位点上的结合,而核酸探针与互补链的反应则是依据杂交体的长短差别,通过氢键几十、几百甚至上千个位点上的结合。这就决议它的特异性。  基因探针依据标志方法差别可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类,依据探针的核酸性质差别又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。DNA探针还有单链和双链之分。

下面分别介绍这几种探针。  
一、核酸探针的种类  
(一)DNA探针  DNA探针是最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获的DNA探针种类很多,有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针,这类探针多为某一基因的全部或局部序列,或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的,如细菌的毒力因子基因探针和人类ALU探针,这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的开展和应用。以细菌为例,当前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要精确的多,是细菌分类学的一个开展方向,加之分子杂交技术的高度敏锐性,分子杂交在临床性病病原体诊断上具有普遍的前景。  DNA探针(包括cDNA探针)有三大优点:第一,这类探针多克隆在质粒载体中,能够无限生殖,取之不尽,制备方法简便。其次,DNA探针不易降解(相对RNA而言),一般能有效抑制DNA酶活性。第三,DNA探针的标志方法较成熟,有多种方法可供选择,如缺口平移法、随机引物法、PCR标志法等,能用于同位素和非同位素标志。  
(二)cDNA探针  cDNA是指互补于mRNA的DNA分子(complementary DNA)。cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶的DNA聚合酶催化发生的。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后,病毒RNA在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA,并进而整合入宿主细胞染色体DNA分子,随宿主细胞DNA复制同时复制,这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下,可被复制多代,但不被表示,故无毒性,一旦因某种因素刺激而被活化,则该病毒大批复制。如其带有癌基因,还可能诱发细胞癌变。  逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术,普遍用于基因的克隆和表示。从逆转录病毒中提取的逆转录酶也已商品化。最常用的有AMV逆转录酶。使用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾,能够合成一段寡聚胸苷酸用作引物,在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cDNA链,然后再用RNase H将mRNA消化掉,再加入大肠杆菌DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链,即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录进程。  所得到的双链cDNA分子经S1核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头(Adapter),再经特定限制酶消化发生粘性末端,即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是λ噬菌体DNA,如λgt、EMBL和Charon 系列等。用这类载体能够得到包含105以上转化子文库,再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此特别适用于基因表示的检测。  
(三)RNA探针  RNA探针是一类很有前途的核酸探针,由于RNA是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采纳的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针,这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制进程中得到标志的,标志效率往往不高,且受多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的,而不是用于检测。例如,在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因组DNA克隆时,因无DNA探针可使用,获得HIV的全套标志mRNA作为探针,胜利地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。  随着体外逆转录技术不断完善,已胜利的树立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体PSP和PGEM,这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动子,在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可进行RNA转录。如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段,则能够以DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高,在1小时内可合成近10μg的RNA产物。只要在底物中加入适量的放射性或生物素标志的dUTP,则所合成的RNA可得高效标志。该方法能有效地操纵探针的长度并可提高标志分子的使用率。  RNA探针和cDNA探针具有DNA探针所不克比拟的高杂交效率,但RNA探针也存在易于降解和标志方法纷乱等缺点。  
(四)寡核苷酸探针  前述三种探针均是可克隆的,一般情况下,只要有克隆的探针,就不消寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时,也常应用克隆探针。克隆探针一般较寡核苷酸探针的特异性强,纷乱度也高,从统计学角度而言,较长的序列随机碰撞互补序列的时机较小引列少。克隆探针的另一优点是,可获得较强的杂交信号,因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标志基因mg娱乐场。但是,较长的探针对付靶序列变异的识别能力又有所降低。对付仅是单个碱基或少数碱基不配的两个序列,克隆探针不克区分,往往杂交信号相当。这既是其优点,又是其缺点,优点是当用于检测病原微生物时,不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊,缺点则是不克用于检测突变点。这种情况,通常要采纳化学合成的寡核苷酸探针。  

合成的寡核苷酸探针具有以下特性:
第一,由于链短,其序列纷乱度低,分子量小,所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。
第二,寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化,因为短探针中碱基错配能大幅度降低杂交体的Tm值。
第三,一次可大批合成寡核苷酸探针,使得这种探针价钱低廉,与克隆探针一样,寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标志物的标志。最常用的寡核苷酸探针长18—40个硷基,当前的合成可有效地合成至少50个碱基的探针。  

对付合成的寡核苷酸探针有以下要求:  
(1)长度以18-50碱基为宜,较长探针杂交时间较长,合成量也低;较短探针特异性较差。  
(2)碱基成分:G+C含量为40%-60%,超出此范围则会增加非特异杂交。  
(3)探针分子内不该存在互补区,否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。  
(4)幸免单一碱基的反复出现。  
(5)一旦选定某一序列相符上述标准,最好将该序列与核酸库中的核酸序列比较,探针序列应与靶序列核酸杂交,而与非靶地区的同源性不该超越70%或有陆续8个或mg娱乐场的碱基的同源。否则,该探针不克用。


分享到:QQ空间新浪微博腾讯微博人人网微信
网友议论 已有[0]人议论
用户名: 暗码: 匿名 快速注册 忘记暗码
议论只代替网友观点,不代替本站观点。 请输入验证码: 8795
Copyright(C) 1998-2019 生物器材网 电话:021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com
条评论