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DNA斑点杂交方法
点击次数:8903 公布日期:2009-2-11  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
斑点杂交(Dot blot)是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品,为使点样精确方便,市售有多种多管吸印仪(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它们有许多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照耀以固定标本,这时的膜就能够进行杂交。
  (1)DNA斑点杂交:
  ①先将膜在水中浸湿,再放到15×SSC中。
  ②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。
  ③用铅笔在滤膜上标好身分,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。
  ④将膜烘干,密封保留备用。
  (2)RNA斑点杂交:与上法类似,每个样品至多加10μg总RNA(经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化),方法是将RNA溶于5μl
  DEPC水,加5μl甲醛/SSC缓冲液(10×SSC中含6.15mol/L甲醛),使RNA变性,然后取5-8μl点样于处置好的滤膜上,烘干。
  (3)完整细胞斑点杂交:应用类似检测细菌菌落的方法,能够对细胞培养物的特异序列进行快速检测,将整个细胞点到膜上,经NaOH处置,使DNA暴露、变性和固定,再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法能够用于筛选大批标本,因为它使细胞直接在膜上溶解,所以DNA含量甚至比常用的提取法还高,又不影响与32P标志的探针杂交,但它不适用于非放射性标志探针,因为DNA纯度不够,会发生高本底。
  斑点杂交实验
  【实验原理】用地高辛标志的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。
  【实验程序】
  1. 处置:将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后,夹在两层滤纸中37℃烘烤20—30 min。(将尼龙膜置入烤箱后立刻进行下一步操作)
  2. 变性:将待测DNA样品(HCV经RT-PCR扩增产物;HBV的PCR扩增产物作为阴性比拟,每组两种样品各10μL)置于PCR仪中100℃加热10min,立刻置冰中,并置于-20℃冰箱中骤冷5min。
  (每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上)
  【原理】 使DNA样品变性,即双链DNA→单链DNA。
  3. 点样:将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上,室温下风干后,于烤箱中120℃烘烤30 min。
  【原理】 使样品中的DNA与膜结合牢固。
  4. 预杂交:将杂交膜封入杂交袋中(每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中),做好剪角标志(勿过大)。用1000μL加样器,加入预杂交液(Dig Easy Hyb),每组5mL全部加完,使尼龙膜恰恰漂起即可,若5mL预杂交液不敷,可适当补加。除去气泡,置42℃恒温摇床上,轻轻振摇30min-60min。
  【原理】 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。
  5. 杂交液制备:用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释,即为杂交液。
  (已准备好)
  6. 杂交:剪开杂交袋一个小角,倾去预杂交液,加入杂交液2-3mL,除去气泡,封口。置50℃恒温摇床上,轻轻振荡留宿。
  7. 洗膜:(1)回收杂交液;
  (2)室温下,用2×wash solution洗膜两次,每次5min;
  (3)将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次,每次15min。
  【原理】洗去未结合的探针,否则会导致过高的本底。
  8. 封闭:取出膜,在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平均后,转入30mL BufferⅡ中,室温作用30-60min。
  【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。
  (在此阶段末期,准备下一步的抗体稀释。稀释方法:加1μL Anti-DIG-AP到10mL BufferⅡ后轻轻混匀,4℃ 可保留12h。)
  9. 酶联抗体结合:将杂交膜封入一个新的杂交袋中,加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室温作用30min,经常摇动,使酶联抗体与地高辛结合。
  10.洗膜:(1)取出膜,将膜放入含有30mL BufferⅠ的培养皿中,洗膜两次,每次15min。
  【原理】洗去未结合的酶联抗体。
  (2)取出膜,将膜放入含有20mL BufferⅢ的培养皿中平均2min。
  11.显色:(1)将45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL BufferⅢ中,显色液必需现配现用!
  (2)在10mL新奇制备的显色底物液中静止避光显色数小时,常在12h内完成显色反应。
  
  核酸杂交法检测病原微生物
  核酸杂交技术是依据两条互补的核苷酸单链能够杂交结合成双链的原理所树立,用一段已知序列的放射性或非放射性标志的核苷酸单链做探针,与待检标本中的DNA杂交来探查待检标本中有无与之相互补的核酸。该方法特异性高,但敏锐性低于PCR方法。
  本实验学习用非放射性标志物-地高辛(DIG)标志DNA片段作探针,用斑点杂交法检测病原微生物DNA的方法。
   【原理】
  用地高辛(DIG)类固醇半抗原标志特异DNA片段做探针,与待检标本中DNA杂交,然后加入碱性磷酸酶标志的抗-DIG抗体(抗DIG-AP),再加入碱性磷酸酶的作用底物(NBT/BCIP),若待检标本中有与探针同源的DNA序列,则探针与其杂交并与抗DIG-AP结合,碱性磷酸酶催化底物呈色,则在杂交膜上出现兰色斑点或条带。该探针可用于斑点杂交,菌落原位杂交及Southern blot杂交。
   (一)DIG-DNA探针的制备(随机引物法标志)
   【原料】
    1. 待标志DNA (0.5~3ug)
    2. 六核苷酸混合物 ( hexanucleotide mix)
    3. dNTP标志混合物,Klenow enzyme
    4. 其它试剂4M LiCl,无水乙醇,TE溶液(10mMTris-HCl,lmM EDTA PH8.0);0.2M EDTA pH8.0
   【方法】
    1. 取待标志DNA(0.5~3ug),加无菌去离子水至终体积15ul,于沸水浴变性10分钟后快速置冰/氯化钠中冷却。
    2. 在冰/氯化钠上添加:
    2ul 六核苷酸混合物( hexanucleotide mix)
    2ul dNTP mix
    1ul Klenow enzyme
    3. 混匀并片刻离心,然后于37℃孵育至少60分钟。
    4. 加入2ul 0.2M EDTA,pH8.0以中止反应。
    5. 加入2.5ul 4M LiCl及75ul经-20℃预冷的无水乙醇,充分混匀, -70℃放置30分钟或-20℃放置2h。
    6. 12000rpm/min离心15min,用50ul预冷的70%乙醇洗涤沉淀物。
    7. 真空片刻干燥,用50ulTE溶液溶解沉淀。
   【说明】
    DIG标志的DNA片断大小为200~1000bp。每次标准标志反应模板DNA量为0.5~3ug,如标志大批DNA需相应增加反应物和反应体积。若延长37℃孵育时间(到20h)可增加DIG标志产物量。
    (二)斑点杂交法
   【原料】
    1. 硝酸纤维素膜,待检标本DNA
    2. 标准预杂交液(5× SSC;0.1%月桂酸;0.02%SDS;1/10体积的10倍浓缩阻断液(含变性并剪切的鲑精DNA)。
    3. 洗液1(2×SSC,0.1%SDS); 洗液2 (0.1×SSC,0.1 %SDS)。
   【方法】
    1. 杂交膜的制备
    ①将从待检标本提取的核酸(质粒或 染色体DNA)100℃ 10 min 煮沸变性,快速置冰/氯化钠中冷却。
    ②膜的处置:用2×SSC ,湿润均匀,37℃烘干后,即可点样
    ③点样:取变性待检核酸1ul 点在硝酸纤维素膜(0.45um)上,同 时设阳性和阴性比拟,室温干燥。
    ④80℃真空干燥2h,将DNA固定于膜上。
    2. 预杂交及杂交
    ①预杂交:将杂交膜放入装有适当体积预热的标准预杂交液的杂交 袋或杂交杯中 ,37℃预杂交 30分钟,轻轻搅拌使膜在该温度下孵育。
    ②将DIG标志的DNA探针置沸水浴5min后,快速用冰水冷却以变 性DNA探针。
    ③将变性的DIG标志DNA探针加入到预热的标准预杂交液(2.5ml/ cm2)中并充分混匀。
    ④将杂交膜放到含DIG标志探针的杂交液中。轻轻搅拌,在68℃ 孵育至少6h(对付检测微量DNA中的单拷贝基因则需孵育16h)。
    ⑤杂交后洗涤:用足够量的2×SSC,0.1%SDS室温漂洗2次,每次5min;用0.1×SSC,0.1%SDS 68℃漂洗2次,每次15min,漂洗进程中需不断轻轻搅拌。
    (三)免疫学检测
   【原料】
    1. 马来酸缓冲液(0.1M马来酸,0.15M Nacl。pH7.5)
    2. 洗液(马来酸缓冲液加入0.3%吐温20(v/v))
    3. 阻断液(10×浓缩的阻断液经马来酸缓冲液10倍稀释,新奇配制)
    4. 检测液(lM Tri s-HCl,0.1MNaCl,50mM Mgcl2,pH9.5(20℃预热)
    5. 显色基底液(加200ul NBT/BCIP浓缩液到10ml检测液中,新奇配制)
   【方法】
    1. 将通过杂交和严厉清洗后的膜用马来酸缓冲液漂洗1~5min;将膜在l00ul阻断液中孵育30min。   
    2. 用阻断液稀释抗D1G抗体至适宜浓度(1:5000左右)。
    3. 倾出封闭液,将膜在20ml抗DIG抗体溶液中孵育膜30min;马来酸缓冲液洗膜2次,每次15min,再用2m1检测液平均膜2~5min。
    4. 将杂交膜在现配制的显色基底液中孵育,并用塑料袋或盒在暗室中密闭保留(显色进程中不克摇动)。
    5. 几分钟内可有颜色沉淀形成(16h完成反应,反应进程中可片刻暴露于阳光下以观察反应进展)。
    6. 当颜色斑点(或条带)抵达肯定强度后,可用50ml去离子水或TE溶液洗膜5min以中止反应。   
    7. 显色后的滤膜可封存于聚乙烯袋内或拍照片保留。
 

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