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原位杂交HPV DNA检测技术应用及体验
点击次数:6735 公布日期:2010-1-20  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
原位杂交技术是新近开展的一项新技术,其原理是采纳荧光、生物素、地高辛等标志的探针,依据碱基对互补配对原理,与组织切片、细胞制片等标本中的靶序列特异杂交,经信号放大显色后,镜下观察结果。此方法具有很高的灵敏性和特异性。本文就HPV DNA检测技术在常规实验中的操作体验等问题,总结如下。
 
1原料与方法
1.1原料南京中医药大学附属第三医院病理科2006~2007年肛肠外科肛周手术病例。其中男性患者45例,女性55例,平均55岁。试剂均购自福建泰普公司的HPV高危型、低危型试剂盒。

1.2方法
1.2.1切片处置将4Ixm厚组织切片粘附在APES处置的载玻片上。
1.2.2脱蜡玻片经二甲苯3次X20min,100%乙醇2次X3min,95%乙醇1次×3min,70%乙醇1次×3min,蒸馏水2移(X3min。
1.2.3微波修复将切片放入盛有1×杂交增强液的容器里,微波高火状态煮30min,自然冷却至不烫手,蒸馏水浸片2次×2min。
1.2.4杂交(1)小心擦干切片后,每张切片可依据组织的大小滴加适量的探针约25 l,并加盖盖玻片。(2)把切片放置于95℃的原位杂交加热器上变性5arin。(3)放入装有30%湿盒增效液的湿盒中,37℃,孵育4~16h(<16h)。(4)48oCPBS浸片,约2rain,小心移去盖玻片,并擦掉组织周围的探针,48oC PBS继续浸泡10min。(5)然后48℃PBS继续浸片3次×5min。
1.2.5信号放大与显色(1)擦去组织周围的液体,滴加适量的一抗(约50 1),37℃,水湿盒中孵育30min,37℃PBS浸片3次X2min(轻微振荡容器)。(2)擦去组织周围的液体,滴加适量的二抗(约50 1),室温,水湿盒中孵育20min, P B S 浸片3 次× 2 m i n 。( 3 ) 擦去组织周围的液体,滴加适量的H R P 聚合物( 约5 0 ¨1 ) ,室温,水湿盒中孵育3 0 ra i n 。( 4 ) 小心擦去组织周围的液体, 滴加适量的D A B 显色剂( 约
5 0 ul ,依据组织的大小增减D A B 的量) , P B S 终止显色。( 5 ) 自来水冲洗残留的D A B , 苏木精复染, 盐酸乙醇分化, 氨水反蓝,梯度乙醇脱水, 二甲苯透明,封固。
1 . 2 . 6 阳性结果推断上皮细胞核呈棕褐色着色为主。
 
2 结果
每例标本均做2 张切片, 分别用高危和低危型探针标志。每批切片标志均设高危和低危阳性比拟。阳性表示结果:高危型6 3 . 5 % ,低危型2 9 . 5 % , 阴性7 % , 高、低同时感染约4 5 . 5 % ( 图1 ~ 4 ) , 说明肛周组织中存在普遍的H P V 感染, 而肛周H P V 感染是否直接致瘤或致癌, 还有待于大样本的系统研究。
 
3 讨论
H P V 属于乳头瘤病毒科,是一种环状双链D N A 病毒,长约8 k b。当前发现的H P V 亚型有2 0 0 种㈦。其主要通过直接或间接的接触或性流传感染人类, 引起人类皮肤和黏膜的多种良性乳头状瘤或疣,某些亚型的感染具有很强的致癌性。近年来随着分子检测技术的开展,我们可从分子的水平更早期的、更精确地, 检测出低拷贝数下的病毒感染情况”。该技术当前已普遍用于宫颈癌的早期的诊断及其它部位病变、病因学等方面的研究。原位杂交方法虽然容易掌握, 但要抵达满足结果, 还需要在制片进程中注意以下几点。

3 . 1 前期处置( 1 ) 组织固定液采纳1 0 % 中性福尔马林或4 % 多聚甲醛磷酸盐缓冲液( p H 7 . 4 ) ;( 2 ) 切片厚度3 — 4¨m ;( 3 ) 烤片温度大于6 0 ℃ , 时间1 h 左右;( 4 ) 建议使用A P E S 处置过的洁净载玻片, 以减少掉片。

3 . 2 操作要点( 1 ) 二甲苯要及时更换, 保证组织脱蜡的洁净;( 2 ) 微波处置须高火,保证3 0 m i n,期间注意补充杂交增强液, 防止干片;( 3 ) 如果使用酶消化, 由于差别的组织,组织存放的时间差别以及切片厚度等存在差异,需要有针对性地探索最佳消化条件;( 4 ) 盖玻片与组织打大小相匹配,保证在高温9 5 ℃ 变性进程中不于片;( 5 ) 建议使用专用的原位杂交仪或变性设施进行高温变性, 以保证变性温度的精确;( 6 ) 杂交温度应坚持在3 7 ℃ , 过高或过低会造成阳性信号减弱或背景升高;( 7 ) 杂交时间为4 ~ 1 6 h 为宜,建议留宿为佳, 以提高低拷贝数病毒的检出率;( 8 ) 在杂交留宿进程中, 要配有3 0 % 增效液的湿盒, 以降低水份对探针稀释的可能性;( 9 ) 3 0 % 增效液的湿盒能够反复使用, 但建议每次使用前补充适量的蒸馏水,幸免因增效液浓度升高造成背景升高;( 1 0 ) 杂交之后请使用4 8 ℃ 高温充分浸片, 以除去非特异性杂交;( 1 1 ) P B S 缓冲液的p H 值应在7 . 4 ~ 7 . 6 之间, 保证最佳洗涤效果;( 1 2 ) D A B 显色液应现配现用, 以保证显色效果。
临床与实验病理学杂志 周伟  ,耿建祥

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