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文献中遇到的实验动物知识:基因敲除小鼠
点击次数:2828 公布日期:2016-3-29  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

菲彩国际水位高不高人:郭晓冲 医科大学动物部

写给看文献的你们:

我在这里想写一些看文献时可能遇到的实验动物知识,希望对大家有帮助。为了便于了解,语言偏通俗,可能不够严谨。如果大家希望深入了解实验动物专业知识,欢迎选修实验动物学。

第一集,关于基因敲除小鼠。

基因敲除小鼠(Knockout Mice),人们使用纷乱的方法使小鼠体内的某一个基因不表示,从而使小鼠呈现这个基因缺失的状态,可用于研究这个基因的功能。

但如果某个基因功能特别重要,这个基因缺失可能具有胚胎致死性,那我们就无法得到这种基因敲除的小鼠了,于是人们发明了条件性基因敲除技术。这一技术能够实现在特定的时间、特定的细胞或组织内使某个基因沉静。方法是首先在目的基因(就是打算敲除的那个基因)的两侧分别插入一段名为LoxP的DNA序列(LoxP序列是一段34bp的DNA序列,两端的13个碱基为回文序列,中间的8个碱基决议LoxP的方向。具体序列如下:5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'

3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5')。然后我们需要用到一种带有Cre酶的转基因小鼠了。

下面分别解释一下转基因小鼠和Cre酶。

转基因小鼠(Transgenic Mice),使用分子生物学方法使小鼠表示了一种小鼠本来没有的基因,这个基因是人为插入的,可能是人的,大鼠的或者别的物种的。这个星球上第一只转基因小鼠就表示了大鼠的生长素(growth hormone)基因,于是那只小鼠长到了大鼠的体型。

Cre酶是在噬菌体内发现的一种酶,它能特异性的识别LoxP序列,并把同方向排列的两个LoxP序列之间的DNA切掉。前面说了,我们把LoxP序列放到了打算敲除基因的两侧,那么我们如果把Cre酶放到细胞核里,目的基因就被Cre酶切掉,从而实现目的基因敲除了。于是人们制作了能够表示Cre酶的转基因小鼠。把Cre转基因小鼠和插入了LoxP序列的小鼠交配,就能够得到同时携带Cre和LoxP序列的小鼠了。当Cre在细胞核内遇见LoxP序列,目的基因就被敲除了。

想操纵在哪个细胞或者什么时间敲除目的基因,只要操纵Cre酶就能够了。制作Cre转基因小鼠时在Cre酶前面放上特异性的启动子,那么Cre酶就在该启动子表示的细胞或组织内表示,这样就只有这个组织或细胞内的目的基因被敲除。

时间上操纵基因敲除的方法更为巧妙。人们修饰了Cre酶基因,修饰后的Cre基因能够转录为mRNA,也能够在核糖体上翻译为蛋白质。但是这种蛋白没有穿过细胞核膜的能力,也就无法进入细胞核发挥切割DNA序列的功能。当人们外源性给予药物他莫昔芬(tamoxifen,缩写TM,是雌激素类似物)后,修饰的Cre酶就会获得穿过细胞核膜的能力。于是Cre进入细胞核,与基因组相遇,切割掉LoxP之间的序列。于是人们实现了什么时刻给药,什么时间敲除基因(当然得给Cre一点时间穿过细胞核膜)。需要注意的是,Cre是一种酶,那么和一切酶一样,它的作用效果不会是百分之百的。也许100个细胞里表示了Cre,大约70个细胞内的基因被敲除。

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Knockin mice,基因敲入小鼠。制作转基因小鼠时,外源基因是随机插入基因组的,具体插入哪个身分不肯定。基因敲入技术能够实现把外源基因精确的插入到指定身分,其原理、方法都和Knock out一样,不外这里我们不讲原理。最开头,人们使用Knockin技术是为了制备Cre小鼠,Cre被插入到ROSA26基因后面,因为ROSA26是一个在一切细胞都表示的一个基因。Cre放在这个基因后面,能够得到全身表示Cre酶的小鼠。以后Knockin技术被mg娱乐场方式的应用,比如把绿色荧光蛋白(GFP)基因放在目的基因末尾,使目的基因与GFP融合表示,那么使用荧光显微镜观察表示绿色荧光的细胞即为表示目的基因的细胞,巧妙的发现该基因的表示身分。

来源:北京众实迪创科技开展有限责任公司
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