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徕卡课堂 | 徕卡,助你驾驭基因编辑的隐形剪刀 ——显微操作技术在基因编辑中的应用
点击次数:2836 公布日期:2016-12-18  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

本文将大致回想小鼠转基因领域的显微操作技术,包括CRISPR/Cas9技术,旨在对这类客户所用的工作流程和术语进行介绍。此外,还针对有用的显微操作系统配置提供一些建议。

显微操作技术概述

图1:CRISPR/Cas9、原核注射和胚胎干细胞移植技术的粗略比较。mg娱乐场详情请参阅下文。

小鼠胚胎早期发育阶段

 

图2:小鼠胚胎早期发育阶段示意图(夜间受精,早上注射。)(来源http://dev.biologists.org/content/137/6/859)

图3:原核阶段示意图(透明带标为红色)

 

图4:囊胚结构示意图

显微操作技术

原核注射(PNI)和胚胎干细胞移植(ESI)

不论是否涉及CRISPR(或者TALEN、ZFN(见第4章)),都要使用原核注射/受精卵注射技术或胚胎干细胞注射技术。这两种技术是成熟的主流技术,在世界范围内使用:

原核注射

受精后约12小时,出现了一个卵子原核和一个精子原核(图2)。在原核融合为一体并构成受精卵细胞核之前,将DNA注入原核阶段受精卵内的一个原核中,直径约80-100µm。注射的靶DNA随机整合到基因组DNA。方向和拷贝数不可预测,即这是一种非靶向技术,快速直接地获得感兴趣的转基因小鼠概率非常有限。

图5:PNI。以固定毛细管固定PN阶段的小鼠胚胎(左侧)。经由毛细管将溶于缓冲液的少量DNA注入其中一个原核(右侧)。可看见被注射的原核发生膨胀。大发娱乐城在线游戏以徕卡DIC采集 。

 

6:PN 注射进程DNA 随机非靶向整合到基因组中

典范的PNI系统设置:

-DMi8:手动、电动部件可供选择

-透射光轴; S28聚光镜及微分干涉差

-5/10倍物镜(FLUOTAR或N PLAN)用于大致观察

-20倍、40倍长工作距离物镜。40倍物镜用于注射

-3板载物台(固定载物台的物体导杆阻碍显微操作器!)

-精选显微操作器(优选直接注入的毛细管:平角有助于尽可能降低胚胎受损程度)

-气压式手动显微注射仪用于固定(逆时针转动发生的负压可固定胚胎)

- FemtoJet®显微注射仪(少量液体,压力x 时间 = 体积)

-依据实验室偏好选择样品载体(玻璃底器皿、盖玻片等)

PN注射通常在室温下借助放大400倍的微分干涉差显微镜(一些还使用IMC)完成。(一些情况下还将胚胎冷却至10°C,使质膜更僵硬以方便注射)

胚胎干细胞移植

胚胎干细胞注入囊胚(图4),囊胚阶段从第3.5天开头,约128个细胞。内细胞群由多能性胚胎干细胞组成,也就是说它们能够发育并分化为差别类型细胞。有时注入八细胞阶段的桑椹胚胎 (图9)。

图7:ESI。以固定的毛细管(左侧)固定小鼠胚囊。经由毛细管将基因修饰的胚胎干细胞注入囊胚腔(右侧)。注射在内细胞群外滋养外胚层细胞之间完成。大发娱乐城在线游戏以徕卡AM6000上的徕卡DIC采集。

注入的胚胎干细胞与内细胞的胚胎干细胞发育为小鼠。这是一只嵌合体小鼠,其细胞/器官来源于注入的胚胎干细胞(雄性)和胚囊(雄性/雌性)。

目的基因的编辑在胚胎干细胞移植注射前完成,这耗时大约3-4个月 ,直至携带基因组DNA靶序列的ES细胞克隆被选定。大局部时间里修饰只出现在一个等位基因,意味着嵌合体是杂合的。发生的克隆在1个等位基因上携带靶突变(在两个等位基因上的概率非常低)。这项技术同意插入大约10-20 kB的DNA。靶向突变所用方法为同源重组。

 

图8:ES细胞DNA的靶向整合/突变

1)使用分子生物学技术创建含有靶DNA以及新霉素抗性位点、翻转酶识别位点(FTR)和CRE重组酶识别位点(loxP)的DNA。

2)通过转染方式将靶DNA注入ES细胞。重组体通过同源重组整合到基因组DNA。

3)往细胞培养物中添加新霉素(一种抗生素),以选择发生的ES克隆。只有具备新霉素抗性的克隆才能存活生长。挑出这些克隆继续培养。

4)添加翻转酶(一种切割DNA并将其重新结合的重组酶),消除新霉素抗性。

5)通过转基因小鼠与另外一只转基因“CRE小鼠”交配,loxP位点能够条件性敲除。表示CRE重组酶的小鼠通常具有类似组织特异性的表示,这种特异性的表示使小鼠具备例如在大脑中的基因的靶向敲除。

经由同源重组及ES细胞注射的靶向突变,多年来已成为“金标准”。与CRISPR相比,不敷之处包括:

  • 载体准备时间长

  • 选择ES细胞克隆费时

  • 载体克隆和ES细胞工作耗时约3个月

  • 生成纯合子小鼠耗时约1年

如上所述,在大约 99% 的案例中,发生的嵌合体是杂合的。最终目的是获得用于研究的纯合子动物。

这是一个费时费力的交配、筛选进程:

1)    胚囊(♀或♂)+ ES细胞(♂)发生♂嵌合体。目的是获得生殖细胞中具有ES细胞修饰的嵌合体

2)    ♂ 杂合嵌合体 + WT ♀发生杂合F1(♂或♀)

3)    杂合♂ + 杂合♀ 发生纯合F2代

纯合子小鼠的两个等位基因上均携带突变。最终获得这些有价值的动物耗时1年左右!

典范的ES移植系统设置:

-DMi8:手动、电动部件可供选择;

-透射光轴;S28聚光镜

-DIC为非必需。胚胎在胚囊阶段已经足够大,其细节容易观察。

- 5/10倍;20倍;40倍长工作距离物镜;较小NA = 较大景深

-3板载物台(固定载物台的物体导杆阻碍显微操作器!)

-精选显微操作器(优选直接注入的毛细管:平角有助于尽可能降低胚胎受损程度)

-气压式手动显微注射仪用于固定

-油压式或油压式带齿轮手动显微注射仪用于注射ES细胞。

ES细胞注射通常在室温下借助放大200倍的DIC/ IMC/PH显微镜完成。

ESI的差异在于将 ES细胞注入8细胞阶段的胚胎中(图9)。这项操作通常使用钝端毛细管完成,以免损伤细胞。激光器(Hamilton-Thorne,Octax或Piezo压电式破膜系统)可帮助钝端毛细管穿过透明带和膜。

图9:ESI注入8细胞阶段的胚胎。钝端毛细管

图10:EMBL转基因进程中使用的DMi8、Eppendorf TransferMan 4r显微操作器和PiezoXpert压电破膜仪。以钝端毛细管进行胚囊注射。DIC

用于小鼠转基因的CRISPR/Cas 9技术

用于小鼠转基因的CRISPR/Cas9技术为靶向突变提供了工具(如ESI),但无需繁杂的ES处置工作!(当然CRISPR也能够用于ES细胞突变)。

转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术是一种更为成熟的技术。TALE(转录激活子样效应因子)是结合DNA特定序列的蛋白质。TALE与核酸酶融合即为TALEN,这是一种具有高度特异性的DNA剪刀。TALEN使双链断裂。修复机制导致靶基因缺失或敲除。

当前,CRISPR技术相对付TALEN技术而言并不昂贵。

另外一种基因组编辑技术是锌指核酸酶技术,它通过在用户指定身分上造成DNA双链断裂而发生作用。

CRIPR/Cas9技术所用的工具如下所示:

向导RNA:这种RNA与用户修饰的靶DNA同源。向导RNA与DNA上的大约20个核苷酸结合。RNA链的别的局部用于结合Cas9核酸内切酶。需要对20个结合的核苷酸进行设计,以找到/发现靶序列。

Cas9核酸内切酶:切割效率高,有时甚至切割两个等位基因。

将向导RNA和Cas9蛋白(或Cas9的DNA或mRNA)注射到受精卵里,Cas 9切割DNA,修复机制开头起作用。该方法在第一代小鼠体内发生点突变的概率高。更先进的技术是注射携带靶基因或突变的同源DNA以及向导RNA/Cas9混合体。经由同源重组插入DNA相当有效。

小鼠转基因用CRISPR/Cas9的优点/缺点:

优点:

+  Cas  9切割效率非常高,有时甚至切割两个等位基因,即可获得同源1代小鼠!

+ 无需繁琐的ES细胞处置工作

+ CRISPR/Cas9技术不依赖于小鼠(而PNI和ESI则依赖),即它也可用于别的物种 (猪等)。

缺点:

-  迄今已颁布的最长插入片段为3kB

-  当前lox P条件性敲除效率低

需要注射高浓度黏性分子(如RNA、蛋白质),会淤塞毛细管。因此需要更粗的毛细管,并且要求平角注射!

 

Cas9高效率地剪切DNA,DNA的修复机制作成了点突变。

 

*注射gDNA+Cas9+同源的DNA

 

图11:CRISPR/Cas9技术

典范的CRISPR/Cas9系统设置

与PN注射设置相同,以下除外:

将浓度较高的黏性CRISPR成分(RNA、蛋白质)注入受精卵时需要使用较粗的毛细管。这些毛细管结构笔直,内径较大,大多数实验室均制作。

因此极力建议沿着真正的平角方向注射(见图10),以幸免胚胎受损。

此外,使用Piezo压电式破膜系统,能够更轻松地穿过透明带,特别是质膜。

显微操作器水平移动,将目的片段注入悬浮细胞内

图12:受精卵注射进程的注射角度。显微操作器水平移动,零度角注射可使胚胎受损程度较轻。注射角度大于10° 将导致受精卵出现较大的“洞”,使其存活率降低。

徕卡显微操作器的移动角度可调,也就是说,即便角度较陡,注射角度本身也是零度角!

这是徕卡显微操作器的一大优点:黏性的向导RNA和cas9蛋白混合物所需的较粗毛细管(减少淤塞)能够沿着零度角方向注射!

别的实验室设施(转基因实验室)

-立体显微镜是选择和操纵胚囊、ES细胞和毛细管必不可少的工具。(如TL5000、M80、Rottermann contrast)

图13:M80及TL5000 Ergo。PN注射后的双细胞阶段。

  • DIC专用玻璃底器皿,一些实验室使用大号盖玻片

  • 毛细管:若干公司提供即买即用产品。许多转基因实验室自己制作毛细管。

直线注射CRISPR/Cas9需要使用内径足够大的毛细管。转基因专家自己制作“高级”毛细管以抵达最高效率。

需要工具:

  • 拉针器(如Sutter、Narishige)

  • 磨具(用于毛细管拉拔后加工)

  • 显微拉制仪(用于曲折毛细管)

上述显微操作器

  • 徕卡机械式显微操作器:转基因领域赞誉颇高的显微操作器类型。角度可调,即使毛细管角度较陡,也可获得零度注射角。稳健可靠,负载能力强,持久耐用。用户众多。当移动徕卡显微操作器的操纵杆时,能够以为到毛细管触及胚胎。

  • Eppendorf TransferMan4r:全主动显微操作器,具有许多附加功能。能够平角注射。气压式、油压式、油压式带齿轮和Femtojet手动显微注射器经常用于别的显微操作器。性能最优,价钱最高。

  • Narishige:新式Takanome显微操作器无平角操作功能。配备MOM-202D和MON-202D后能够平角操作。油压式显微操作器当然首屈一指。注射器:IM 9B、IM 9C、IM-11、IM300。

防震:在很大程度上取决于注射室位于地下室还是高层建筑的十层(不论需要与否)。采纳被动(铁板、深重石桌、网球等)和主动设置。

徕卡DMi8转基因系统特性

•    高度模块化的倒置研究显微镜 – 依据客户需要提供手动/电动组件

•    载物台高度低 – 工效学效果更佳,胚胎操作更安定

•    显微镜稳定 – 振动较少

•    完善的徕卡光学系统!

•    最佳DIC!– 原核可视

•    智能主动化 – 单击按钮便可使用/停用光学部件

•    集成调制和相衬 –  标准物镜没有调制器/PH圈

•    微型徕卡显微操作器操作台(身分接近显微镜,因此接近光轴/试样)

•    徕卡操作器总是零度角注射!

•    徕卡显微操作器:可靠、精确、知名度高

与Eppendorf和Narishige显微操作器兼容

参考文献

  1. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering

  2. Haoyi Wang, Hui Yang, Chikdu S. Shivalila, Meelad M. Dawlaty, Albert W. Cheng, Feng Zhang, Rudolf Jaenisch, Cell 153, 910-918, May 9, 2013

  3. -Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system

  4. Albert W Cheng, Haoyi Wang, Hui Yang, Linyu Shi, Yarden Katz, Thorold W Theunissen, Sudharshan Rangarajan, Chikdu S Shivalila, Daniel B Dadon and Rudolf Jaenisch, Cell Research (2013) 23:1163–1171. doi:10.1038/cr.2013.122; published online 27 Aug 2013


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