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详解CRISPR基因编辑技术的利与弊
点击次数:5282 公布日期:2017-8-15  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

说到基因编辑,大家都会想起CRISPR技术。这个当年名声大噪的技术,现今依旧热度不减,特别是我们的CRISPR大神张锋,近期公布的文章频频亮相于知名杂志,又引起一片热议。时过境迁,CRISPR技术并没有销声匿迹,一直在线。但任何事物包括技术有利就有弊,CRISPR技术当然也毫不例外。

CRISPR技术就是这么好用!

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火了四年之久的技术,耳熟能详的优势显而易见:摒弃了对付ES细胞的依赖,CRISPR技术实现了对大鼠、猪、猴、斑马鱼等多种物种的编辑;CRISPR技术依赖于Cas9和sgRNA实现“精准”切割,简化实验程序,大大缩短实验周期。周期短、工作量小,随之而来的就是费用的降。综上,性价比高的技术当然当仁不让的会一直火。

CRISPR技术也有缺点?

CRISPR技术自问世以来,被应用至世界各地众多实验室中进行科学研究,在享受其优势的同时,它的弊端也是众所周知:sgRNA与Cas9蛋白这哥俩,并不是时时刻刻都兢兢业业工作的,谁还没有倦怠的时刻呢?本应该精准定位的sgRNA也有走眼的时刻,本应该识别标准PAM序列 的Cas9蛋白,也偶然不走心,结果就是脱靶,影响了编辑的效率。

有“病”不可怕,关键是“对症下药”?

医生治病讲究对症下药,科研思路也不例外。找出原因解决问题,既然是sgRNA和Cas9蛋白出现了毛病,那么我们就针对差别病症采纳差别方式:

优化sgRNA

(1)改变自我:改变sgRNA 的长度,截断5' 端的2-3 个碱基或在识别序列前加2 个鸟嘌呤,切割活性稳定, 脱靶率降低5000 倍。

(2)提升自我:增加sgRNA 的稳定性。如在gRNA 中增加一对A-U 碱基配对等方法。此外, 有研究表明Cas9 直系同源酶对某些位点的特异性较SpCas9 高,这无疑为提高特异性提供了一条新思路。

提高Cas9蛋白自身特异性

    专一性对付家庭是很重要,而对付CRISPR技术也是很重要。专一性一方面与自身有关,另一方面也与情况的诱惑有关,因此对付Cas9蛋白,我们要从内和外两个因素去考虑。

(1) 擦亮眼睛,辨认出谁是你的Mr/Mrs Right:增强Cas9 蛋白对标准PAM 序列的识别能力,突变体D1135E对标准PAM 的识别更加特异,从而降低因识别非标准PAM 序列而引起脱靶。

(2)与对的人相亲相爱就好,不要老是沾花惹草:将Cas9蛋白进行定点突变形成eSpCas9和SpCas9-HF1,突变体减弱了Cas9 蛋白与DNA 的非特异性结合的能力,增强靶向序列与Cas9 蛋白结合的竞争力。

(3)减少外界诱惑:调控Cas9 蛋白在细胞中的表示量。通过使用诱导型启动子、插入4-HT 依赖的内含肽等方法构建诱导型Cas9 蛋白,减少基因组暴露于Cas9 与sgRNA 复合体的时间, 即减少Cas9 与非靶向序列的结合概率,进而降低脱靶率。

(4)断舍离:仅保留其核酸识别能力,断除其核酸内切酶的活性。当然对付自身也是必须的:降低HNH 或RuvC 结构域功能的突变体H840A 和D10A;构建使Cas9 蛋白损失核酸内切酶活性,借助别的核酸内切酶实现基因编辑的CRISPRi和FokⅠ-dCas9

百奥赛图杀手锏——Southern blot检测金标准

sgRNA设计严谨

舍弃可能脱靶到有功能基因组序列的sgRNA

纯RNA注射

缩短Cas9蛋白和sgRNA的作用时间

Southern blot检测

对大批数据统计数据分析发现,采纳ES细胞方式制备,随机插入概率约为20%,采纳CRISPR/Cas9技术,大约有32%的概率有随机插入。而这32%中有14%的随机插入无法依靠交配传代去除,排除随机插入的金标准是Southern blot百奥赛图严把质量关,坚持进行Southern blot检测,确保基因编辑获得的动物无随机插入。

Southern杂交的目的是为了检测目的基因的插入身分及拷贝数量。Southern blot杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法,其操作进程:使用电泳离别经酶消化后的DNA片段,然后再将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或别的固相撑腰物上,经干烤或者紫外线照耀固定,再与相对应结构的DIG标志探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量。  

参考:

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[2] Kleinstiver B P, Prew M S, Tsai S Q, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities[J]. Nature, 2015, 523(7561): 481.

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[4] Müller M, Lee C M, Gasiunas G, et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome[J]. Molecular Therapy, 2016, 24(3):636–644.

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制作:

MIT麦戈文脑科学研究所

张锋

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来源:北京百奥赛图基因生物技术有限公司
联系电话:010-56315318
E-mail:info@bbctg.com.cn

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