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CRISPR/Cas9技术,热度背后的冷思索
点击次数:5652 公布日期:2018-4-17  来源:李晓明

近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正在给整个科研界带来革命性变化,该技术使用CRISPR系统将Cas9蛋白和向导RNA注入小鼠受精卵,就能轻松实现基因敲除,同时,注入Donor DNA则可实现基因敲入,甚至国际著名学术期刊Genome Biology有文章指出这项新技术将很快取代使用胚胎干细胞的基因修饰,看起来小鼠胚胎干细胞基因修饰技术的终结不可幸免。


然而,事实是这样吗?


脱靶效应仍存争议


CRISPR/Cas9这一被称为“魔剪”的基因编辑工具在基因工程应用方面被寄予厚望。但是,脱靶效应这一有争议的老问题一直影响着CRISPR/Cas9系统的应用。有文献报道,CRISPR/Cas9的切割是通过gRNA与基因组身分之间20bp碱基的配对,且配对碱基的 5′ 端需要有PAM结构,再引导Cas9作用实现的,但是CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与接近PAM处10-12bp碱基的配对,而别的远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不显著,这项研究直接说明了CRISPR/Cas9存在严峻的脱靶性,即该技术能够发生非特异性切割,引起基因组非靶向位点的突变,这样会造成研究结果的不确定性。

去年在Nature Methods杂志上公布的研究“Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo”通过全基因组测序分析表明CRISPR基因编辑会引入数百种不可预估的突变到基因组中,文章所指出的大范围脱靶问题,对CRISPR的应用提出了尖锐的挑战,却又在今年3月30日出现反转并进行了撤稿处置。值得注意的是,这篇文章的第一作者Kellie A Schaefer和相同第一作者Wen-Hsuan Wu均同意撤稿,而包括通讯作者Alexander G Bassuk以及Vinit B Mahajan在内的别的四位作者则差别意撤稿。这与通常的撤稿情况还是有所差别,一般的撤稿大多数情况貌似都是通讯作者要撤稿,这篇争议性文章通讯作者则坚持了自己的意见。显然,这篇文章在研究者们内部也有巨大分歧。

不外,也有研究表明,CRISPR的脱靶问题并没那么严峻:bioRxiv期刊上的研究“Whole genome sequencing of multiple CRISPR-edited mouse lines suggests no excess mutations.”指出,多个采纳CRISPR/Cas9技术基因编辑的小鼠品系通过全基因组测序后的结果显示,CRISPR/Cas9技术可在生物水平上精准地对基因组进行编辑,并没有引入很多非预期的脱靶突变。

从以上这些充满争议性的研究能够看出,在应用CRISPR/Cas9技术时,其脱靶效应仍需小心考虑。综合来看,现阶段修饰精确、效果稳定、脱靶率极低的ES打靶技术仍是研究者的较优选择。


CRISPR/Cas9技术当前难以胜任纷乱的基因编辑


另一方面,对付纷乱的基因修饰(如条件性敲除、条件性点突变和大片段敲入等),CRISPR有先天不敷,因为此时需要Donor DNA与受精卵中基因组的特定身分发生同源重组,而同源重组的效率很低。相反,ES打靶技术在这一方面因其flox地区范围大、对付纷乱结构宽容度高、打靶一次胜利率高等特性,会有显著的优势。


CRISPR/Cas9专利之争仍存争议,商业化应用存在较大隐患


对付CRISPR/Cas9技术,还有一个值得关切的是其专利使用问题,CRISPR/Cas9专利是基于多家机构的研究结果,产权不清楚,一直存在一切权之争。


2017年初,Broad研究所和协作者们被授权了关于真核生物细胞(包括人类细胞)的基因组编辑的CRISPR专利,而加州大学伯克利分校和协作者授权的专利是关于将CRISPR技术用于到cell-free系统中,并不是涉及真核细胞的基因组编辑。然而,后者对这一判决结果并不悦足,不悦足的结果就是启动专利抵触程序(interference proceeding)。通过该程序一个发明者能够接手另一个发明者的专利。


来自咨询公司IPStudies2017年的数据显示,当前还有763项和Cas9相关的专利,在这些专利中,有些声称拥有某些CRISPR/Cas9基因编辑方面的专利权,随着时间过去,这些专利的拥有者或许也会试图去维护他们的权利。


CRISPR专利的纷争给一些商业机构带来了巨大的狐疑。 首先,这意味着在未获得CRISPR/Cas9技术专利授权的商业机构购买基于CRISPR/Cas9技术提供的技术服务和产品,存在着较大的法律风险;其次,很难保证从一家专利一切人购买的专利能笼盖一切应用需求。


应用CRISPR/Cas9技术公布的文章数量和质量低于ES打靶技术公布的文章


通过Google学术搜索2013年至今有关CRISPR/Cas9基因敲除和ES打靶技术有关的文章,搜索knockout “embryonic stem cell” or “ES cell” 找到约17300条结果,搜索knockout “crispr” or “cas9” 找到约16100条结果。

 

针对两个搜索结果,随机抽检搜索列表中的100篇文献,统计分析后发现采纳ES打靶技术公布的文章平均影响因子比CRISPR/Cas9技术公布的文章高2.1 IF。因此,不论从文章质量还是数量,当前CRISPR/Cas9技术的影响力仍弱于金标准的ES打靶技术。不外不可因此否认CRISPR/Cas9技术未来潜在的影响力。

综合以上几个方面来看, 近年来一直处于风口浪尖的热点CRISPR/Cas9基因编辑技术已经出现过多次类似的“危机”,虽然有很多优势,但学界仍需对其坚持冷静态度,随着差别国家、差别地域的研究者们在CRISPR领域孜孜探究,也许这次一系列事情对CRISPR来说并非危机,反而是推动其开展的重要力气,我们也希望科学家们能够不断去探究,优化工艺,以期将基因组编辑技术被更普遍应用于临床的疾病治疗。

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