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Circulation Research |器官特异性血管遗传靶向技术及应用
点击次数:4973 公布日期:2018-5-31  来源:南模生物

5月15日,科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组在国际学术期刊Circulation Research上公布了题为“Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels”的最新研究结果。该项工作树立一套新的遗传操作系统以实现更加精确的遗传靶向,可用于基因敲除和过表示。

南模生物为该研究构建了顺次交叉遗传靶向工具小鼠模型。

 

到当前为止,遗传靶向工具主要依赖于Cre-LoxP同源重组系统以解决细胞示踪问题,进行基因功能研究。该系统的精度在很大程度上取决于驱动Cre的启动子或基因表示的特异性。也就是指,如果将Cre表示元件插入到A基因中,那么在表示A基因的细胞中能够发挥Cre重组作用。而A基因往往并不克特异性地只在某种特定器官或组织中表示,所以这种传统方法具有固有的局限性。

例如:研究血管常用的遗传工具鼠有VE-cad-Cre、Tie2-Cre等,然而这些工具鼠标志的是一切的内皮细胞,而无法精确地研究特定组织器官的血管。差别器官的血管在结构及功能上是异质性的。差别器官的内皮细胞在损伤反应中的作用都是奇特的。因此,如何提高遗传靶向的精度,开拓组织特异性Cre工具鼠,对付研究特定细胞类型在某一种器官形成及再生进程中的深入功能研究具有重要意义。

在这项最新的研究中,研究人员精妙地使用Cre-loxP和Dre-rox两套系统,相互排他的重组系统进行顺次交叉遗传靶向操纵,实现精确地遗传靶向器官特异性的血管。

 

核 心:顺次交叉遗传靶向操纵系统

两个要素:

两种差别的启动子分别来驱动Dre和Cre —— A-Dre 和 B-CrexER(下图B)。

  • A-Dre:通过 knockin 方式,将 Dre 插入到 A基因座中,使 Dre 的表示与 A基因的表示谱一致。

  • B-CrexER:通过 knockin 方式,将 CrexER 元件插入到 B基因座中。CrexER是一种新型的诱导型工具鼠——将两个rox位点分别放置于雌激素受体(ER)的两侧,即Cre-rox-ER-rox。

按照这个顺次交叉靶向系统的设计(下图C),一般情况下,Cre-ER融合蛋白停留在细胞质中,无法入核进行Cre-LoxP反应。只有在同时表示A基因和B基因的细胞中,Dre重组酶将识别并切割Rox位点,之后B-Cre从细胞质中释放入核,进行后续的Cre-LoxP重组反应。

图0.jpg

 

使用神经嵴表示的 Nrg1-CrexER 与普遍表示的 CAG-Dre 验证了  CrexER 在经 Dre 切除了 ER-rox 后,Cre-rox融合蛋白仍具有重组酶活性,且特异而有效地在体内发挥Cre重组酶作用。并且 CrexER本身没有漏表示情况的发生。这些数据验证了Dre介导的Cre表示的策略的可行性,并证实了这种新型CrexER可用于进行体内顺次交叉遗传靶向。

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图1. Proof-of-principle for a sequential recombination strategy for genetic targeting.

 

顺次交叉遗传靶向操纵系统是使用两个启动子更加精确地限定了标志的细胞,并且最后的有效输出是Cre重组酶。而两个标志基因A和B的选择对付整个系统是否胜利至关重要,需要前期文献与实验中对表示谱有全面的了解。

这项研究中,研究人员就分别在心脏和大脑中各找到了2个Marker基因,胜利地实现了在心脏和大脑中特异性标志血管内皮细胞。

 

应用1:心脏冠状内皮细胞特异性CoEC-Cre

  • Tie2-Dre:Tie2是泛内皮细胞标志物,在大多数血管以及某些骨髓细胞群中均有表示。通过将Dre敲入到内源Tie2基因的ATG身分,树立Tie2-Dre工具鼠。

  • Wt1-CrexER:有报道称间皮细胞标志物Wt1在发育中的冠状动脉血管中表示,但不在别的血管中表示。除了心外膜细胞外,Wt1-CreER在胚胎心脏中标志冠状内皮细胞。通过将CrexER插入到Wt1基因的翻译起始暗码子(ATG)身分,树立Wt1-CrexER工具鼠。(图2A-B)

验证实验结果显示,Tie2-Dre;Wt1-CrexER确实能够特异且有效地标志冠状血管(图2C-E)。作为内部比拟,没有检测到Tie2-Dre;R26-tdTomato组织中的任何tdTomato+细胞,从而排除了Dre-loxP重组。Wt1-CrexER; T26-tdTomato小鼠中在未给他莫昔芬处置的情况下,也没有检测到任何tdTomato+细胞,说明Wt1-CrexER没有漏表示。

 

这些数据表明Cre-loxP重组仅在Tie2-Dre和Wt1-CrexER双重组系统中才发生,Tie2-Dre;Wt1-CrexER(以下简称 CoEC-Cre )可排它性地特异靶向心脏血管。接下来验证双重组系统在基因敲除或过表示中的应用。

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图2. Genetic targeting of coronary vessels by Tie2-Dre;Wt1-CrexER line.

 

冠状血管内皮细胞中特异性基因操纵

心脏特异性血管中的基因敲除

VEGFR2(Kdr)在大多数器官的内皮细胞中普遍表示,过去要在冠状动脉中特异性靶向该基因几乎是不可能做到的,因此选择Kdr基因作为靶基因来验证CoER-Cre系统在条件性基因敲除中的应用。

通过Kdr flox小鼠与CoEC-Cre(Tie2-Dre;Wt1-CrexER)交配(图3A)。为了同时能够示踪,再引入R26-tdTomato报告基因小鼠。

  • 敲除组为:Tie2-DRE;WT1-CrexER; Kdrflox/flox;R26-tdTomato小鼠;

  • 同窝比拟组为:Tie2-DRE;WT1-CrexER; Kdrflox/+;R26-tdTomato小鼠。

E14.5心脏切片免疫染色检测tdTomato、VEGFR2和CDH5,结果显示VEGFR2在tdTomato+ CDH5+冠状内皮细胞敲除组小鼠心脏的致密心肌内的缺失(图3B-D)。而在心肌小梁的心内膜细胞中,VEGFR2表示不受影响,表明CoEC-Cre重组特异性靶向表示Wt1的冠状内皮细胞,而不是心内膜内皮细胞(胚胎期不表示Wt1)。

心脏特异性血管中的基因过表示

选择人类白喉毒素受体(DTR)作为过表示基因。将CoEC-Cre与R26-iDTR小鼠杂交,其中DTR表示受Cre-loxP重组作用的操纵(图3E)。能够通过白喉毒素(DT)处置来特异性消除表示DTR的冠状内皮细胞,从而验证这套系统在基因过表示中也是可行的。免疫染色显示仅在冠状内皮细胞中表示DTR(图3F);内皮细胞形态的严峻破坏,说明细胞凋亡(图3G)。Tie2-Dre; Wt1-CrexER; R26-iDTR小鼠DT给药组和未给药比拟组的心脏切片TUNEL+细胞数目有显著差异(图3H,I)。

综合上述基因敲除和过表示两个实验,表明新的基因靶向系统能够实现排它性地在冠状动脉内皮细胞中允进行基因操作,而不影响别的器官系统。

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图3. Gene knockout and over-expression in coronary endothelial cells.

 

应用2:大脑内皮细胞特异性BEC-Cre

  • Tie2-Dre:同上文

  • Mfsd2a-CrexER:先前的研究表明Mfsd2a在脑内皮细胞中表示,但也在别的细胞类型中表示(图4A)。将编码CrexER的cDNA插入到Mfsd2a基因的第一个外显子的ATG身分,树立Mfsd2a-CrexER工具小鼠,并验证了该小鼠中CreER的表示。然后将Tie2-Dre工具鼠与之交配,获得Tie2-Dre;Mfsd2a-CrexER双阳性小鼠(以下称为BEC-Cre)(图4B)。

与常规靶向脑血管和神经元的Mfsd2a-CreER相比,BEC-Cre能够有效且特异地靶向脑血管,特异性优于Mfsd2a-CreER,而不标志任何神经元(图4C-E)。更重要的是,除了特异性,BEC-Cre相比传统的Mfsd2a-CreER,能够在脑内皮细胞中更有效地发挥Cre重组作用(图4E)。另外,BEC-Cre没有靶向任何门静脉肝细胞,也没有靶向别的器官或组织中的血管。tdTomato+内皮细胞在脑和别的器官或组织中的百分比定量统计也证实了BEC-Cre小鼠的效率和特异性(图4G)。

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图4. Specific and efficient brain endothelial cell targeting。

 

脑特异性血管内皮细胞中的基因操纵

脑特异性血管中的基因敲除

 

同样地,再次使用VEGFR2(Kdr)作为靶基因,获得基因敲除组(Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER; Kdrflox/flox; R26-tdTomato)和同窝比拟组(Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER; Kdrflox/+; R26-tdTomato)小鼠(图5A)。在新生小鼠大脑中,基因敲除组几乎检测不到VEGFR2+血管(图5B-C);而别的器官或组织中的血管中没有检测VEGFR2表示的降低,证明Kdr在脑血管中的特异性缺失。与比拟组相比,基因敲除组中的血管密度显著降低(图5D);还观察到无血管地区的扩大,大脑缺氧的情况显著增加(图5E),证实脑血管密度降低对组织氧合的影响。除了减少的血管生成外,敲除组小鼠脑血管的形态异常(图5F)。

另外,通过注射10-kDa葡聚糖示踪实验以及tdTomato、红细胞标志物Ter-119、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)免疫染色,发现毛细血管泄漏,证实Kdr缺失对血管完整性的影响(图6A-C)。并且,Kdr敲除组小鼠大脑内皮细胞蛋白质组成也发生了变化,BBB内皮细胞中显著诱导出了原本并不表示的质膜囊泡相关蛋白(PLVAP)(图6D)。在BEC-Cre介导的Kdr特异性敲除小鼠中,β-catenin(CTNNB1)的表示显着减少(图6E)。

综合这些结果,使用BEC-Cre介导脑血管特异性敲除,规避了常规全身Kdr敲除的胚胎早期致死,并证明Kdr是中枢神经系统血管生成所必需的。VEGF信号通路调节了与BBB内皮细胞完整性相关的基因。

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图5. Specific knockout of VEGFR2 in brain endothelial cells.

 

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图6. Vegfa-Vegfr2 signaling regulates BBB integrity.

 

这项研究胜利构建了心脏冠状动脉特异性Cre(CoEC-Cre)和大脑血管特异性Cre(BEC-Cre),并使用顺次交叉遗传靶向系统揭示了VEGF信号通路参与调控大脑血管新生及血脑屏障的形成。

 

 

随着 knockin 技术的日益普及,Cre工具鼠的树立已经变得越来越便捷;这也就使得特异性靶向的基因敲除与基因过表示能够变得越来越精细。

Dre与CrexER联用的这种新的顺次交叉遗传靶向系统能够实现在特定细胞群体中进行精确的基因操作,为组织特异性基因操作提供了一个有效的策略,能够普遍地应用到别的生物医学领域。是不是很妙呢?

南模生物使用CRISPR基因编辑技术和ES细胞打靶技术,为该研究构建了包括:Nrg1-CrexER, Nrg1-CreER, Wt1-CrexER, Tie2-Dre, Mfsd2a-CrexER 在内的多种工具小鼠模型。

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来源:上海南方模式生物科技股份有限公司
联系电话:400-728-0660
E-mail:tech@modelorg.com

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