English | 中文版 | 和记娱乐城官方站版 企业登录 | 个人登录 | 邮件订阅
厂商 仪器 试剂 服务 新闻 文章 视频 高级搜索 公布求购
当前身分 > mg娱乐场 > 技术文章 > 课堂 | 生物医学研究新工具:FLIM-FRET生物传感器
课堂 | 生物医学研究新工具:FLIM-FRET生物传感器
点击次数:2714 公布日期:2018-12-7  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
荧光寿命成像(FLIM)与Förster共振能量转移(FRET)相结合,已被证明非常有利于生物医学研究中各种结构和细胞动态变化的研究。因为FRET信号强烈依赖于FRET配体和受体的距离,所以FRET同意监测分子相互作用。这同意研究分子的相互作用,如配体-受体复合物,蛋白质-蛋白质相互作用、效应蛋白与DNA的相互作用等。 另一方面,随着对FRET了解的深入,科学家已经能够设计FRET探针,以便获得可控的供体-受体结合、释放效率。对付FRET探针,我们能够分为两种类型的分子相互作用:探针内的FRET供受体和探针与配体的相互作用。 今天小编将详细介绍什么是FLIM和FRET,以及FLIM-FRET的结合带来的几个应用实例。

“ 当前,大多数生物探针都是基于荧光。荧光探针亮度的增加或减少取决于其浓度。但是,荧光强度不但受研究工具浓度的影响,还受照明强度、光漂白以及基质汲取和阴影效应等。为了尽量幸免这些问题,科学家倾向于优先选择比率染料(ratio-dyes),因为其同意对背景的干扰进行校准。尽管如此,基于荧光强度的测量并不是非常可靠,因为即使采纳细心设计的校准方法,反复性也还是不够理想。 FLIM提供了更好的方法,因为荧光寿命与染料浓度、照耀强度以及荧光信号在样品中的汲取和散射无关,因此对分子间相互作用不会发生影响。另一方面,荧光寿命受情况的影响显著,这使得FLIM可用于测量情况参数的影响:在一些特别的分子情况情况下,存在第二种染料,其能够汲取第一种染料发射的能量——FRET。该进程为寿命测量提供了一种灵敏的方法。对付这种组合技术,越来越多的探针被开拓出来,并用于生物医学研究:FLIM-FRET生物传感器。”

什么是FLIM?

荧光的激发发生在具有适当光子能量(激发光)的情况下。汲取光子后,分子内的原子释放少量热量)。因此,与激发光相比,发射光具有更长的波长。此外,能量释放还能够通过与低能光子的相互作用来触发,此种情况被称为受激发射,是STED超高分辨显微镜的基本原理。最后,能量也能够完全释放而不发射光子,从而降低荧光效率。 荧光图像通常被认为是发射光的二维强度分布。可测量的强度是激发波长或发射波长或两者的函数。通过对一系列陆续或不陆续光谱独立或同时检测来测量发射信号。最终结果用于构建彩色图像、离别信号通道、分辨空间和时间中目的的相互作用等。然而,荧光进程也提供了额外的信息维度:与强度无关的荧光寿命。荧光寿命可用于在受控条件下识别和离别荧光物质,并揭示分子情况的细节。 荧光激发后,荧光分子会在激发态停留一段时间,然后衰变回基态。它们处于激发态的时间是不可预测的,因为它是量子力学操纵的随机进程。这种进程的一个众所周知的例子是不稳定原子核的放射性衰变,而每种核素的半衰期都是非常特别的。对付荧光,处于激发状态的时间τ即为荧光寿命。除了强度特征之外,荧光寿命的特别性使其成为区分荧光染料的行之有效的方法。 因此,FLIM图像不代替每个像素的强度,而是提供像素位点的寿命信息[1]。

经典的FLIM测量方法(时间相关单光子计数,TCSPC)确实测量单个位点的荧光寿命事情。像素信息是“平均抵达时间”,即在该像素中测量的一切寿命事情的平均值,或者是直方图中对抵达时间进行曲线拟合提取的一个或多个特征时间。为了获得显著结果,每个像素应该测量大约400个TCSPC。因此,我们经常听到的有关荧光寿命测量的抱怨:“寿命分析太纷乱了!”。

什么是FRET?

Förster共振能量转移(FRET)是一种影响荧光测量的淬灭现象。上文已经介绍,除了发射光子,分子还能够释放全部激发能量而不发生辐射。如果猝灭分子也是荧光染料,则能量能够通过共振转移到受体(A)从而供体(D)没有发生光子辐射。因此,释放的能量不会作为热量消散,而是存储在受体荧光染料的激发态[2]。对付FRET的发生条件,受体的激发光谱必须与供体的发射光谱重叠,并且两个分子也必须紧密接触和排列身分适当。在这种情况下,“紧密接触”意味着距离不该超越大约10纳米。分子越近,FRET发生的概率就越高。 FRET模型 距离和转移速率kF之间的联系: 其中R0表示“Förster半径”,它是转移效率为50%的供受体间的距离。Förster半径假定为每个供体-受体对的特定值。供体激发的特性寿命用τD表示,r为两种分子之间的实际距离。由于转移速率与r6成反比,因此FRET仅在供体和受体紧密接触时发生。由于这种联系是奇特的,因此,最初FRET仅用于估量分子距离(“分子标尺”)。此外,绝对的FRET效率还取决于供体发射和受体激发的重叠程度以及两种荧光染料的能量转移方向。 整个进程:供体D被短波长光子Ex激发,能量以非辐射方式(FRET)传递给受体A,受体发射长波长光子Em。

下面两个现象的发生能够辨别FRET的发生。

首先,样品(受体)发出的荧光颜色差别于独立供体受激发而发射的颜色。对付图3中的示例,在蓝色激发之后供体不该发射红色光。能够测量该发射并与供体发射进行比较的方法称为“sensitized emission”。 Sensitized emission可量化FRET的发生。这种测量能够在活体样本中进行,但是如果以荧光强度进行测量则需要纷乱的校正,因此能够用于各种误差校准。同样,寿命测量也是可选择的方法。FRET对寿命的影响将在本文最后一节中介绍。

其次,供体发射减少,因为一些供体激发将变为受体激发。这种现象能够用于“受体光漂白”的测量,即在通过光漂白根除受体时测量供体发射的变化。去掉受体后,供体发射将增加。该方法仅适用于固定样品。 FLIM-FRET生物传感器 用生物方法进行的标志能够统称为“生物传感器”,能够是蛋白质或肽、DNA或RNA片段、细胞等,甚至整个生物体也能够作为生物传感器,例如检测污染水毒性的死亡率筛选实验中的淡水鱼。在更大约念下,生物传感器还能够包括含有生物学局部和光电学的用于测量分析物浓度的复合传感器。众所周知的是,例如,葡萄糖生物传感器——糖尿病患者用于操纵血糖的快速且简单的装置。FLIM-FRET生物传感器通常表示使用荧光(寿命)作为信号并且发生FRET的荧光现象。

到当前为止,我们已经了解FLIM-FRET生物传感器的工作原理。

第一局部是探针:通常是与分析物(目的分子)相互作用的蛋白质或肽。蛋白质和肽能够方便地通过基因工程方法引入到靶标内,因此是优选的传感分子。最著名的例子是钙调蛋白。钙调蛋白可结合Ca2+离子并在结合或排除结合时发生构象变化。

第二局部涉及荧光。我们需要用一对能够进行能量转移的荧光染料标志的分子。荧光染料分子必须以肯定的方式连接到探针上,即在一种构象状态下它们相距很远并且不克进行能量转移,但在替代构象状态下它们相距很近、且排列身分适当,并且触发后能进行能量转移。当探针结合或释放被分析物时,FRET会发生或消逝。我们能够通过Sensitized emission来测量结合或释放的程度。如果使用荧光蛋白作为荧光染料,则整个生物传感器能够在遗传上表示,并能够被引入任何生物靶标中,甚至是特定的亚细胞结构。适合的供受体对如:作为供体的CFP(青色荧光蛋白)和作为受体的YFP(黄色荧光蛋白)。

第三局部是寿命测量。如上所述,通过强度进行的Sensitized emission测量容易出现显著的误差,并且需要麻烦的校准和纷乱的校正(主要是因为强度受许多别的因素的影响,不但仅是那些对FRET进程有影响的因素)。寿命基本上仅取决于荧光染料种类和所处情况的影响。在FRET的情况下,与纯荧光发射相比,荧光寿命将会缩短。在图4中,使用蓄水池(类似于激发态存储的能量)排水来解释寿命缩短的原因。如果供体只能发出荧光(绿色),那么相当于只有一个排水管操纵排空蓄水池的速度(a)。如果供体能够将能量转移到受体,则犹如在蓄水池中打开第二个排水管(红色),结果是水将更快地被排空(b)。 . a):在没有FRET的情况下,供体分子的激发态能量库D 仅通过发射光子来释放能量。因此,激发态的能量仅被一个操纵激发态的寿命的漏极(绿色液滴)决议;b):如果受体分子能够从供体分子汲取激发能量,则存在第二个排出通道用于排空激发态能量库。因此,耗尽更快,因此,在发生FRET的情况下,寿命更短。 这种寿命差异用于检测特定分析物(分子内FRET)结合后传感器分子的构象变化。当然,能够以相同的方式研究用适合的FRET供受体中两个分子之间的任何相互作用。 因此,如果我们测量供体的寿命变化,就能够监测整个传感器的构象转换,并由此监测分析物浓度的变化。如果结合的构象导致较低FRET的发生,则供体寿命将相对付分析物浓度增加,反之亦然。 为了以足够的精度和速度测量体内动态变化的荧光寿命,仪器需要高灵敏度,兼具快速帧频、以及时间相关单光子计数区分的适当方法[3]。

FLIM-FRET的应用示例 为了说明FLIM-FRET在21点网上赌博游戏生物医学科学中的作用,小编在此举下面两个例子。 FLIM-FRET应用不但涵盖用于分析物检测的生物传感器,还涵盖蛋白质、肽、核酸等的各种相互作用。典范地应用如荧光蛋白CFP和YFP或衍生物的使用。

一 细胞Ca2+研究 Ca2+离子在细胞生理学中具有许多重要作用,例如,作为细胞信号传导中的第二信使。它是肌肉收缩的必需成分,能够释放神经递质,并有助于活细胞的膜电位稳定。它也是许多酶反应和血液凝固的重要因子。 为了研究这些功能,有必要使用在活细胞内快速且高效代谢的探针。标准FLIM-FRET生物传感器实例之一是Ca2+指示剂“cameleon”(请参考本文引用文献)。有各种各样的cameleons,其名称表示对Ca2+敏锐性及其颜色变化,如chameleon [4]。 Cameleon探针中的传感器是钙调蛋白。它在与钙结合后会发生构象变化。具有两个荧光蛋白,例如CFP和YFP,形成FRET-biosensor。 Cameleon钙传感器在Ca2+离子结合时显示FRET,即在钙存在的情况下寿命将缩短。

二 细胞cAMP研究 细胞信号传导中同样著名的第二信使是cAMP,它被发现是盘基网柄菌子实体发育进程中的形状调控因子[5]。cAMP是激素的细胞内信使,欠亨过细胞膜转移,因此在碳水化合物循环和脂质代谢中起关键作用。它还涉及一些离子通道的调节。 与cameleon类似,通过将cAMP结合蛋白Epac与两种荧光蛋白融合,能够构建生物传感器[6] [7]。 FLIM-FRET还可用于近些年多种热门研究中,如非干扰性绘制细胞球3D培养中代谢状态的空间和时间变化[8],FRET-Biosensor(T2AMPKAR)用于监测肿瘤球体中AMPK(5'腺苷-磷酸激活的蛋白激酶)的活性。为了充分成像球状体的3D结构,能够使用LEICA TCS SP8 DIVE多光子系统进行激发。 这些例子只是生物医学研究中FLIM-FRET应用的一小局部。蛋白质、供体与受体、DNA与蛋白质或DNA片段与RNA的相互作用都可用荧光寿命结合荧光供振能量转移的方法进行研究。因此,FLIM和FRET领域中的研究结果将在不久的未来显着增加!

参考
1.Gerritsen et al: Fluorescence Lifetime Imaging in Scanning Microscopy. Pawley J (Ed) Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed. Springer New York (2006)
2.Förster T: Energiewanderung und Fluoreszenz. Die Naturwissenschaften. 6, pp166-175 (1946) 3.Borlinghaus RT: Lifetime - a Proper Alternative. Leica Science Lab (2018)
4.Miyawaki A et al: Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388, pp882-887 (1997)
5.Konijn TM et al: The Acrasin Activity of Adenosine-3’-5’-cyclic Phosphate. PNAS 58, pp1152-1154 (1967)
6.Ponsioen B et al: Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO reports 5/12, pp1176-1180 (2004)
7.Klarenbeek J et al: Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLoS One, 10/4 (2015)
8.Chennell G et al: Imaging of Metabolic Status in 3D Cultures with an Improved AMPK FRET Biosensor for FLIM. Sensors (Basel), 16/8: 1312 (2016).

分享到:QQ空间新浪微博腾讯微博人人网微信
网友议论 已有[0]人议论
用户名: 暗码: 匿名 快速注册 忘记暗码
议论只代替网友观点,不代替本站观点。 请输入验证码: 8795
Copyright(C) 1998-2019 生物器材网 电话:021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com
条评论